POROS疏水填料的应用
POROS疏水填料去除双特异性抗体聚体——工艺设计与去除机理
双抗项目聚体多，一不小心就中招
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今天羊驼博士就带大家一起看看
POROS的疏水填料
在流穿模式下对双抗项目中聚体去除的
效果及背后隐藏的机理
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简 介
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减少和控制产物相关杂质是双特异性抗体纯化工艺开发过程中的主要挑战。目标产物变体（例如聚体和片段）去除的困难源于它们性质的相似性，相近的等电点、小的表面电荷差异和对不同盐盐和pH条件的疏水性。因此，许多双特异性抗体纯化过程需要多个步骤来减少杂质。这里研究了三种疏水相互作用层析（HIC）填料（POROS Ethyl，Benzyl和Benzyl-Ultra），用于去除基于大肠杆菌的表达系统（XpressCF+™）中产生的双特异性抗体的聚集体。进一步研究了POROS苯甲基疏水填料的最佳工艺参数。
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研究目标
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对系列填料在双抗在聚体去除效果上的对比，包括结合洗脱模式及流穿模式。
评估POROS 疏水填料在聚体去除上的效果和双抗单体回收率。
研究POROS Benzyl 在放大规模上对于聚集体去除的动态载量。
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物料与耗材
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双特异性抗体：大肠杆菌无细胞系统 (XpressCF+™)表达的bsAb1
耗材：
低疏水性和高疏水性HIC PreDictor 96孔板
POROS Ethyl, Benzyl和Benzyl Ultra 1mL预装柱
层析柱: Tricorn, HiScale, and AxiChrom
设备和软件
AKTA Avant 25, 150和 Pilot 系统
Unicorn 7.3
UHPLC 1290 Infinity II System
Chromeleon 7.2
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方 法
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筛选琼脂糖基架疏水填料
结合洗脱模式和流穿模式筛选的12种琼脂糖基架疏水填料
在 PreDictor 板和1mL 柱子上测试
高盐条件在结合洗脱模式下容易形成bsAb1沉淀
流穿模式下收率低且bsAb1形成的聚体去除效果有限
POROS 疏水填料筛选
POROS Ethyl（疏水性最弱的填料）POROS Benzyl 和Benzyl Ultra（疏水性最强的填料）通过上Protein A纯化的料液 到15cm高的疏水柱上来测试。
聚体去除效果排名为 Benzyl-Ultra > Benzyl > Ethyl， 收率则刚好相反。
POROS Benzyl 在bsAb1聚体去除效果和收率上表现非常出色。
注：Strip1 with water, strip2 with 1M acetic acid, CIP with 1M NaOH
表二 POROS Benzyl 在放大180倍后的聚体去除一致性
方框内的上样载量可以使高聚体去除15-20% ，单体回收率在 75-85%之间。
图6 双抗聚体在POROS Benzyl填料FT模式下的流穿
1、文章显示POROS 填料在优化好的条件下可以在维持高单体回收率的同时具有去除聚体的优越能力。
2、POROS Benzyl 流穿模式可以去除 >10-20% 聚体（取决于上样量），可以很好的作为中间层析步骤。
3、研究结果表明，在有效分离双特异性抗体和其聚集体的过程中，聚集体的去除可以通过流穿模式取代吸附洗脱模式。
